Glavni
Scarlet groznica

Humani levkocitni interferon: indikacije, navodila za uporabo

V tem članku bomo govorili o eni izmed učinkovitih protivirusnih in imunostimulacijskih zdravil. Gre za človeški levkocitni interferon. Preglejmo lastnosti zdravila, indikacije za njegov namen, navodila za uporabo in tako naprej.

Značilnosti zdravila

Humani levkocitni interferon (mednarodno ime - interferon alfa) je na voljo v dveh oblikah - raztopini za inhalacijsko in intranazalno uporabo in suhem liofiliziranem prahu (včasih stisnjenem v tablete). Tekoča oblika je barve od brezbarvne do svetlo rožnate, suha - od bele do rožnate.

Interferon levkocitični človek (Interferon levkocitični človek) je kompleks proteinov, ki jih sintetizirajo levkociti krvi darovalca pod vplivom virusa induktorja interferona. Očistite jih z ultra- in mikrofiltracijsko metodo.

Analogi tega imunomodulacijskega zdravila:

Orodje se lahko uporablja v kombinaciji z drugimi zdravili. Zdravilo se izda brez zdravniškega recepta, ki velja 2 leti od datuma proizvodnje. Hranite ga na temnem in hladnem mestu (2-8 stopinj nad ničlo). Hranite izven dosega otrok!

Povprečne cene za humani levkocitni interferon so relativno nizke. Torej, v večini lekarn paket z 10 ampulami zdravila bo stala 80-120 rubljev.

Sestava zdravila

1 ml tekočega humanega levkocitnega interferona vsebuje:

  • Interferon Alfa - 1000 ie.
  • Natrijev klorid - 0,09 mg.
  • Natrijev dihidrogenfosfat dihidrat - 0,06 mg.
  • Natrijev hidrogenfosfat dodekahidrat - 0,003 mg.
  • Destilirana voda za injekcije je približno 1 ml.

Farmakološke lastnosti

To imunomodulacijsko zdravilo sodi v farmakološko skupino citokinov. Njegove lastnosti so naslednje: t

  • Imunostimulacija - krepi imunski odziv.
  • Imunomodulacija - normalizira imunski status.
  • Antibakterijski učinki - boj proti različnim vrstam mešanih okužb.
  • Protivirusno delovanje - pomaga telesu, da se upre boleznim, kot so herpes, gripa, adenovirusne bolezni.
  • Protivnetno, protitumorsko delovanje.

Suhi in tekoči proizvod ni strupen, sterilen, neškodljiv, če ga dajemo skozi dihala. Ne uporabljajte praška za injiciranje.

Indikacije za uporabo

Humani levkocitni interferon se uporablja za preprečevanje akutnih virusnih okužb in za zdravljenje zgodnjih oblik bolezni z začetnimi simptomi.

Indikacije lahko razdelimo v tri glavne skupine:

  • Intranazalna uporaba: preventivni ukrepi in zdravljenje SARS, gripe.
  • Parenteralna uporaba: genitalne bradavice, hepatitis B in C, ne-Hodgkinov limfom, maligni melanom, multipli mielom, ledvični karcinom, Kaposijev sarkom pri bolnikih z aidsom (ki trenutno nimajo akutnih okužb), dlakavocelična levkemija, glivična miozoza.
  • Rektalna uporaba: zdravljenje kroničnega in akutnega virusnega hepatitisa.

Prav tako bo zdravilo učinkovito:

  • kronična mieloidna levkemija;
  • primarna in sekundarna trombocitoza;
  • prehodno obdobje kronične granulocitne levkemije, mielofibroza;
  • retikulosarkom;
  • multipla skleroza.

Kontraindikacije

Navodila za uporabo humanega levkocitnega interferona kažejo naslednje kontraindikacije za uporabo zdravila:

  • Epilepsija.
  • Kršitev funkcij centralnega živčnega sistema.
  • Okvarjeno delovanje ledvic in jeter, hematopoetski sistem.
  • Organska srčna bolezen.
  • Kronični hepatitis pri osebah, katerih nedavno zdravljenje je vključevalo imunosupresive.
  • Bolezni ščitnice.
  • Kronični hepatitis.
  • Ciroza jeter z znaki odpovedi jeter.
  • Nosečnost in dojenje.
  • Alergija.
  • Povečana individualna občutljivost na aktivno komponento - interferon alfa, kot tudi na vsa zdravila beljakovinskega izvora, na piščančje meso in jajca.

Zdravilo je nevarno za jemanje v naslednjih primerih:

  • Rok uporabnosti je potekel.
  • Celovitost embalaže je ogrožena.
  • Na embalaži ni oznak.

Odmerjanje in uporaba

Navodila za uporabo humanega levkocitnega interferona predpisujejo:

  • Pri otrocih, mlajših od 3 let, zdravilo dajemo le intranazalno (škropljenje, vkapanje).
  • Otroci, starejši od 3 let, so dodatno dovoljeni za odrasle.

Intranazalna uporaba. Neposredno pred uporabo se odpre viala z zdravilom. Nato se doda ohlajena kuhana ali sterilna destilirana voda, natančno do kapi 2 ml na kapsulo. Izdelek se rahlo stresa, dokler se popolnoma ne raztopi.

Zdravilo se injicira v nos z brizgo brez igle ali medicinske pipete. Druga metoda je škropljenje: lahko uporabite bodisi škropilnico tretje osebe ali tisto, ki prihaja s pripravkom. Šoba je nameščena na injekcijsko brizgo brez igle, nato pa jo pripeljala blizu nosnega prehoda ali v njej približno 0,5 cm. Pršenje poteka s pritiskom bata brizge. Bolnik mora sedeti z glavo navzgor.

  • Preprečevanje: velja za celotno tveganje okužbe. Vsadek - 5 kapljic, sprej - 0,25 ml v vsakem nosnem prehodu. Dnevna manipulacija se izvede do 2-krat v presledku najmanj 6 ur.
  • Zdravljenje: pri prvih znakih bolezni. 5 kapljic ali 0,25 mg v vsako nosnico. Postopek se ponovi do 5-krat na dan s presledkom 1-2 ur.

Otroci in odrasli prejemajo humani levkocitni interferon v istem odmerku.

Vdihavanje. Uporaba vdihavanja je bolj učinkovita. Za to, morate kupiti inhalator od katerega koli proizvajalca. Za en postopek je potrebna vsebina treh kapsul, ki jih je treba raztopiti v 10 ml vode, segreto na 37 stopinj. Na ta način zdravilo dajemo skozi usta in nos dvakrat na dan 2-3 dni.

Injiciranje agenta je prepovedano!

Neželeni učinki

Pri uporabi tega imunomodulacijskega zdravila so možni naslednji neželeni učinki: t

  • Na strani prebavil: sprememba okusa, suha usta, napenjanje, zaprtje, bruhanje, driska, slabost, izguba apetita. V redkih primerih - kršitev jeter.
  • S strani centralnega živčnega sistema: ataksija, zaspanost ali motnje spanja, oslabljena zavest, depresija, živčnost.
  • S strani srca in krvnih žil: aritmija, arterijska hipotenzija.
  • Dermatološki učinki: kožni izpuščaj, rahla alopecija, eritem, suha koža.
  • Gripi podobni sindrom: šibkost, zvišana telesna temperatura, mialgija, glavobol.
  • Drugi: granulocitopenija, občutek šibkosti, letargija, izguba telesne teže, motnje vida, omotica.

Posebna navodila

Previdno uporabite orodje, ko:

  • Nedavno je doživel miokardni infarkt.
  • Myelodepresija, spreminjanje strjevanja krvi.
  • Starejši bolniki, pri katerih so pri uporabi velikih odmerkov zdravila ugotovili neželene učinke iz centralnega živčnega sistema. Morda je celo vredno prekiniti zdravljenje.
  • Bolnike s hepatitisom C pred zdravljenjem je treba testirati na raven TSH v krvi. Samo z normalnimi indikatorji se lahko začne terapija z interferonom. V drugih primerih je možna kršitev delovanja ščitnice.
  • V kombinaciji z opioidnimi analgetiki, hipnotiki, sedativi.

Humani interferon levkocitov je učinkovito imunostimulirajoče antiinfektivno sredstvo. Ima številne značilnosti uporabe in kontraindikacije, zato se morate pred uporabo seznaniti z navodili.

Interferoni. Pridobitev interferona

Tema: Interferoni. Pridobitev interferona.

Interferone smo odkrili leta 1957 na Nacionalnem inštitutu za medicinske raziskave v Londonu kot dejavnike odpornosti na virusno okužbo. Ugotovljeno je bilo, da živalske celice, ki so bile izpostavljene virusu, sproščajo faktor v okolje, ki je sposoben dajati zdravo celico odpornost na virusno okužbo: zdelo se je, da preprečuje (moti) razmnoževanje virusov v celici in se zaradi te sposobnosti imenuje interferon. Obstajajo tri vrste interferona:

α, β, ki se pripisuje prvemu razredu, γ-interferon, pripisati drugemu razredu.

Interferon-α, ki ga proizvajajo levkociti, ima pretežno protivirusni, antiproliferativni in protitumorski učinek.

Interferon-β, ki ga tvorijo fibroblasti, ima pretežno protitumorski in protivirusni učinek.

Interferon-y - proizvajajo T-limfociti in naravni morilci (N-celice) in se imenujejo limfociti in imunski. Ima pretežno imunomodulatorno in šibko protivirusno delovanje.

proizvodni interferon inducirane razred virusi Ι, dvoverižna RNA, dvojnoverižna sintetičnih oligonukleotidov interferon izdelki - y - virusnih in bakterijskih antigenov ali determinante antiserumov proti površina limfotsitov.Protivovirusny učinek zaradi sposobnosti interferona v celicah aktivira sinteze dveh encimov - oligoadenylate-sintaze in proteinske kinaze inhibirati biosintezo beljakovin in razmnoževanje virusa v okuženi celici, kar povzroči njeno lizo. Enak mehanizem antiproliferativnega protitumorskega delovanja interferonov.

Interferon-γ je multifunkcionalni imunomodulatorni limfokin, ki vpliva na rast in diferenciacijo celic različnih vrst. Aktivira makrofage v fazi prenosa antigenskih informacij v limfocite, poveča njihovo antimikrobno in protitumorsko aktivnost, proizvodnjo IL-1. IF-γ aktivira naravne celice ubijalke, citotoksične limfocite, ki zavirajo rast tumorjev.

Interferoni-α so beljakovine in β in γ-interferoni so glikoproteini, so tipični globularni proteini. Dve disulfidni vezi smo našli v α-interferonih. Interferoni so nizko molekularni proteini z 146-166 aminokislinskimi ostanki, specifičnimi za vrste, t.j. humani interferon je biološko aktiven v človeškem telesu, mišji interferon je le v miši.

Najbolj raziskani interferoni so α-interferoni; število genov, ki jih kodirajo za približno 20, se nahajajo na kromosomu 9. V zvezi z β-interferonom je bil izoliran le en protein, ki ustreza humanemu β-interferonu-interferonu β 1 - skoraj vsa protivirusna aktivnost ustreza temu. Možno je, da v genomu obstajajo številni geni, ki kodirajo različne β-interferone. Geni β-interferona se nahajajo na kromosomu 9. t Interferon-γ predstavlja samo en posamezni protein, ki ga kodira en gen, ki se nahaja na 12. kromosomu.

Pridobitev interferona. Interferoni so eden najučinkovitejših sredstev za zdravljenje virusnih okužb, vendar so specifični za posamezne vrste in se lahko pridobijo le iz človeških celic. Tehnologija izolacije in čiščenja interferona je neučinkovita, predvsem zaradi izredno nizkega donosa končnega produkta (iz 1 l krvi se lahko ekstrahira le 1 μg interferona, tj. Približno en odmerek za injiciranje).

Na tej stopnji je najbolj obetavna metoda biosinteza interferonov z uporabo gensko spremenjenih mikroorganizmov. CDNA, pridobljeno z reverznim transkripcijo, je bila klonirana v E. coli. Gen interferona smo vstavili v vektorsko DNA in dodali bakterijske regulatorne elemente, ki programirajo njegovo transkripcijo in translacijo v bakterijski celici. Najprej se interferoni v celici sintetizirajo kot prekurzorji, ki vsebujejo signalni peptid na N-koncu polipeptidne verige, ki se nato razcepi, in tako nastane zreli interferon, ki ima polno biološko aktivnost. Bakterije ne vsebujejo encimov, ki bi lahko odcepili signalni peptid in tvorili zreli protein. Zato, da bakterije sintetizirajo zreli interferon, je treba v plazmid vnesti le del gena, ki ga kodira, in del gena, ki kodira signalni peptid, je treba izbrisati. Ta postopek je bil izveden, kot sledi. Gen interferona vsebuje tri mesta za razgradnjo restrikcijskih encimov Sau 3A1, od katerih se eden nahaja blizu signalnega dela. Nepopolno cepitev gena s tem encimom vam omogoča, da izberete genski fragment, ki vsebuje nukleotidno zaporedje, ki kodira zreli interferon, vendar brez prvega cisteina. Triplet ATG, ki kodira cistein, se razcepi z encimom skupaj s signalnim delom. Za ponovno vzpostavitev polinukleotidnega zaporedja celotnega gena je bil kemično sintetiziran majhen fragment DNA, ki je vseboval ta triplet in ATG triplet, ki ga je spremljal - točko začetka sinteze beljakovin. Ta fragment je bil vezan na izoliran del zrelega gena in kot rezultat je bil izterjan celoten zreli gen interferona. Rekonstruirani gen smo uvedli v plazmid tako, da se je poleg njega pojavil promotor DNA, ki je začel sintezo mRNA. Ekstrakti iz E. coli, ki vsebujejo tak plazmid, so imeli antivirusno aktivnost. Interferon, sintetiziran z metodo genskega inženiringa, je bil izoliran, očiščen in njegove fizikalno-kemijske lastnosti so bile blizu tistim iz interferona, pridobljenega iz krvi darovalcev. Bakterijo, ki je sposobna sintetizirati do 5 mg interferona na 1 liter bakterijske suspenzije, ki vsebuje približno 1011 bakterijskih celic, je bilo mogoče dobiti, kar je 5000-krat večje od količine interferona, ki se lahko ekstrahira iz 1l donorske krvi.

Pri uporabi tehnologij genskega inženiringa v različnih laboratorijih so bili pridobljeni bakterijski sevi, ki so proizvajali različne interferone: α-, β- in γ-vrste. Pomanjkanje uporabe E.coli za proizvodnjo β- in y-interferonov je odsotnost glikozilacijskega aparata za evkariontske proteine ​​v bakterijah, kar vodi do sinteze ne-glikoliziranih molekul. In čeprav je vloga glikolizacije nejasna in ne-glikolizirani β- in γ-interferoni skoraj v celoti ohranijo protivirusno aktivnost, ta značilnost narekuje previden pristop k uporabi gensko spremenjenih zdravil v medicinski praksi.

Trenutno so geni interferona klonirani v kvasovke in višje evkariontske celice, sposobne glikozilacije. Leta 1981 so bile v Združenih državah Amerike prvič uporabljene gensko spremenjene celice Saccharomyces cerevisiae za sintezo humanega levkocitnega interferona. Nastala učinkovita ekspresija gena LeIF in zamenjava bakterij s kvasnimi celicami je omogočila 10-kratno povečanje proizvodnje interferona.

Interferoni so na voljo kot zdravila v obliki kapljic za nos, mazil in raztopin za injiciranje. Obstajajo naravni interferoni, pridobljeni iz limfocitov darovalske krvi in ​​umetno sintetizirani z uporabo tehnologij genskega inženiringa (rekombinantni). Trenutno se v Rusiji in tujini proizvajajo komercialni pripravki - človeški levkociti, limfoblastni (Velferon) in fibroblastični (Feron) ter interferoni, pridobljeni z metodami genskega inženiringa: rekombinantni α-interferon (Roferon, Realderon, itd.), Β- interferon in γ-interferon (gamaferon).

Metoda za pripravo humanega imunskega interferona

Uporaba: biotehnologija, medicinska industrija. Bistvo izuma: konstruiranje rekombinantnega plazmida pSV 69, vključno z fragmentom DNA-kodirajočega prekurzorja humanega imunskega interferona; transformirajo pridobljeno rekombinantno vektorsko celično linijo COS-7, izberemo transformirane celice, ki jih gojimo v pogojih, ki zagotavljajo kopičenje ciljnega produkta, in izoliramo zrelo obliko interferona brez N-terminalnega Cys-Tyr-Cys (des-Cys-Tyr-Cys interferon). 8 bolnih.

Risbe patenta Ruske federacije 2107728

Izum se nanaša na tehnologijo rekombinantne DNA, na sredstva in metode za uporabo takšne tehnologije pri razkritju zaporedja DNA in njegovega določenega zaporedja aminokislin za humani imunski interferon, njegovo proizvodnjo, kot tudi na različne produkte, dobljene z njimi, in njihovo uporabo.

Natančneje, predloženi izum se nanaša na izolacijo in identifikacijo zaporedij DNA, ki kodirajo humani imunski interferon, in na konstrukcijo rekombinantnega ekspresijskega vektorja, ki vsebuje te DNA sekvence, ki so operativno vezane na promotorske sekvence, in na izvedbo ekspresije z dobljenimi vektorji. V drugem vidiku se predloženi izum nanaša na sisteme kulture gostiteljev, kot so razni mikroorganizmi in kulture celic vretenčarjev, transformirane z ekspresijskimi vektorji in tako usmerjene k ekspresiji prej omenjenih DNA zaporedij. V drugem vidiku se predloženi izum nanaša na sredstva in metode za pretvorbo končnih produktov takšne ekspresije v nove predmete, kot so farmacevtski sestavki, primerni za zdravljenje in profilakso ljudi.

V prednostnih izvedbah pričujoči izum zagotavlja specifične ekspresijske vektorje, ki imajo takšne sekvence, da je človeški imunski interferon proizveden in izločen iz gostiteljskih celic v zreli obliki. Poleg tega se predloženi izum nanaša na različne postopke, ki se uporabljajo za pridobivanje takih DNA zaporedij, ekspresijskih vektorjev, sistemov kulture gostiteljev in končnih produktov in njihovih derivatov, kot tudi do specifičnih in sorodnih pogojev.

Predloženi izum je delno izveden iz odkritja zaporedja DNA in uveljavljene aminokislinske sekvence, ki kodira humani imunski interferon. Poleg tega predloženi izum zagotavlja informacije o zaporedju 3 "- in 5" stranskih sekvenc gena humanega imunskega interferona, ki olajša njegovo vezavo in vitro na ekspresijske vektorje. Zlasti je bil ugotovljen 5 'DNA segment, ki kodira predlagani endogeni signalizacijski polipeptid, ki je neposredno pred aminokislinskim zaporedjem domnevnega človeškega zrelega človeškega interferona. pa tudi možnost določitve biokemičnih lastnosti in bioaktivnosti.

Publikacije in drugi materiali, uporabljeni za osvetlitev prostorov izuma, kot tudi v nekaterih primerih za poudarjanje dodatnih podrobnosti v zvezi z njegovo uporabo, so vključeni s sklicevanjem, zaradi lažjega razumevanja, oštevilčeni v naslednjem besedilu in ustrezno nameščeni na priloženem seznamu bibliografij.

Ozadje izuma
A. Imunski humani interferon
Človeške interferone lahko razvrstimo v tri skupine glede na različne antigenosti ter biološke in biokemične lastnosti.

Prva skupina je družina levkocitnih interferonov (interferon, Le IF ali IFN-), ki jih običajno proizvajajo večinoma ustrezne človeške krvne celice pod vplivom virusov. Ti interferoni so bili pridobljeni z mikrobiološko metodo in ugotovljena je bila njihova biološka aktivnost (1, 2, 3). Njihove biološke lastnosti so določile njihovo uporabo v klinikah kot terapevtska sredstva pri zdravljenju virusnih okužb in malignih stanj (4).

Druga skupina vsebuje humani fibroblastični interferon (interferon, FIF ali IFN-), ki ga običajno proizvajajo fibroblasti pod vplivom virusov, ki so bili pridobljeni tudi z mikrobiološkimi metodami, in ugotovljeno je bilo, da kaže širok razpon bioloških aktivnosti (5). Klinična preskušanja prav tako kažejo na njegovo potencialno terapevtsko vrednost. Interferoni levkocitov in fibroblastov imajo zelo opazno podobnost v svojih bioloških lastnostih, kljub dejstvu, da je stopnja homologije na ravni aminokislin relativno nizka. Poleg tega imata obe skupini interferonov od 165 do 166 aminokislin in sta kislinsko stabilni proteini.

Humani imunski interferon (- -interferon, IIF ali IFN-), ki je predmet predloženega izuma v nasprotju z - in - interferonom, pH 2, je labilen, dobimo ga predvsem z mitogeno indukcijo limfocitov in je tudi povsem drugačen pri antigenskih lastnostih. Do nedavnega se človeški imunski interferon lahko dobi le v zelo majhnih količinah, kar je naravno otežilo karakterizacijo. V zadnjem času so poročali o veliko večji, vendar še vedno delni čiščenju človeškega imunskega interferona (6). Poročali so, da je bila ta spojina pridobljena iz kultur limfocitov, stimuliranih s kombinacijo fitohemaglutinina in forbol estra in prečiščena z uporabo zaporednih kromatografskih separacij. Kot rezultat tega postopka smo dobili produkt z molekulsko maso 58.000.

Človeški imunski interferon je bil pridobljen v zelo majhnih količinah prevodov mRNA v oscite, ki kažejo značilnosti delovanja interferona interferona človeka, in upanje, da se lahko imunski interferon cDNA sintetizira in klonira (7).

Količina do sedaj pridobljenega imunskega interferona je očitno nezadostna za izvedbo nedvomnih poskusov karakterizacije in določanja bioloških lastnosti prečiščene komponente. Študije in vitro, ki so bile izvedene z neprečiščenimi zdravili, kot tudi in vivo poskusi s pripravki interferona podgan, je bilo predpostavljeno, da je lahko glavna funkcija imunskega interferona funkcija imunoregulacijskega sredstva (8 in 9). Imunski interferon ima ne le protivirusno in anti-celično aktivnost, ki je skupna za vse humane interferone, temveč tudi potencialni učinek na te aktivnosti in -interferonov (10). Poleg tega naj bi bil antiproliferativni učinek α-interferona na tumorske celice in vitro približno 10 do 100-krat večji kot pri drugih razredih interferonov (8, 11, 12). Ta rezultat, skupaj z njegovo izrazito imunoregulacijsko vlogo (8 in 9), kaže na veliko bolj izrazito protitumorsko sposobnost za IFN kot za FN in IFN-. V poskusih in vivo z mišmi in podganami IFN-zdravila kažejo precejšnjo superiornost v primerjavi z interferoni, stimuliranimi proti virusu, v smislu protitumorske aktivnosti proti osteogeni sarkomu (13).

Pred predloženim izumom je bilo treba vse te študije opraviti na bistveno kontaminiranih pripravkih zaradi njihove izjemno nizke razpoložljivosti. Vendar pa so nedvoumno potrdili zelo pomembne biološke funkcije imunskega interferona. Imunski interferon ima ne le glavno protivirusno aktivnost, ampak tudi verjetno močno imunoregulacijsko in protitumorsko aktivnost, ki jo jasno opredeljuje kot potencialno obetaven klinični objekt.

Jasno je bilo, da bi morala biti uporaba tehnologije rekombinantne DNA najučinkovitejši način za pridobitev potrebnih velikih količin človeškega imunskega interferona. Ne glede na to, ali tako pridobljene snovi vključujejo glikozilacijo, ki se šteje za značilnost naravnega materiala, ki izvira iz človeka, bodo očitno pokazali bioaktivnost, ki določa njihovo klinično uporabo pri zdravljenju številnih virusnih bolezni, novotvorb in stanj z zavrnjenimi imuniteto.

B. Tehnologija rekombinantne DNA
Tehnologija rekombinantne DNA je dozorela.

Molekularni biologi lahko z lahkoto rekombinirajo različne zaporedje DNK in tako ustvarijo nove vrste DNA, ki lahko v transformiranih mikroorganizmih proizvedejo znatne količine eksogenih beljakovinskih produktov. V bistvu so bili razviti sredstva in metode za in vitro vezavo različnih fragmentov DNA s topimi ali "lepljivimi" konci, s pomočjo katerih so pridobljeni potencialni ekspresijski vektorji, ki so primerni za transformacijo specifičnih mikroorganizmov, s čimer se uravnava usmerjena sinteza želenih eksogenih produktov. Za posamezne izdelke pa ta pot ostaja precej težka in znanost še ni dosegla stopnje, na kateri bi lahko zagotovili uspeh.

Plazmid, nekromosomska zanka dvoverižne DNA, najdena v bakterijah in drugih mikroorganizmih, pogosto v obliki večkratnih kopij na celico, ostaja bistveni element tehnologije rekombinantne DNA. Informacije, kodirane v plazmidni DNA, vključujejo informacije, potrebne za razmnoževanje plazmida v hčerinskih celicah (t.j. vir replikacije) in ponavadi eno ali več fenotipskih selekcijskih lastnosti, kot je odpornost na antibiotike za bakterije, ki omogoča, da kloni gostiteljske celice vsebujejo plazmid, ki ga je treba prepoznati in prednostno rasti na selektivnem mediju. Uporaba plazmidov je dejstvo, da lahko specifično cepijo eno ali drugo restrikcijsko endonukleazo ali "restrikcijski encim", od katerih vsak prepozna različne dele plazmidne DNA. Potem lahko v plazmid vključimo heterologne gene ali fragmente gena z vezanjem koncev na mesto cepitve ali na rekonstruirane konce, ki ležijo ob mestu cepitve. Tako dobimo tako imenovane vektorje za izražanje, ki jih je mogoče ponoviti. Rekombinacija DNA poteka zunaj celice, vendar pa lahko nastali rekombinantni vektor ali plazmid, ki se podvoji, vnesemo v celice na način, znan kot transformacija, pri čemer nastanejo velike količine rekombinantnih vektorjev kot posledica rasti transformanta. Še več, če je gen ustrezno usmerjen proti delu plazmida, ki nadzoruje transkripcijo in translacijo kodirne DNA, lahko dobljeni ekspresijski vektor uporabimo za dejansko pridobitev polipeptidnega zaporedja, ki ga kodira vstavljeni gen, t.j. za proces, ki se imenuje izraz.

Ekspresija se začne v regiji, ki je znana kot promotor, ki jo prepozna in veže RNA polimeraza. V transkripcijski fazi se ekspresija DNK odvija, tako da se odpre kot kemična matrica za sproženo sintezo glasbene RNA iz zaporedja DNA. Informacijska RNA se nato prevede v polipeptid z aminokislinsko sekvenco, ki jo kodira mRNA. Vsaka aminokislina je kodirana z nukleotidnim tripletom ali "kodonom", ki skupaj tvorita "strukturni gen", to je del, ki kodira aminokislinsko zaporedje eksprimiranega polipeptidnega produkta. Prevajanje se začne z "startom" - signalom (ponavadi ATG, ki v nastali informacijski RNA postane AUG). Tako imenovani "stop" kodoni določajo konec oddajanja in s tem povezavo naslednjih aminokislinskih enot. Ciljni produkt lahko dobimo z liziranjem gostiteljske celice, če je potrebno, in ločitvijo produkta z ustreznimi postopki čiščenja od preostalih proteinov.

V praksi lahko uporaba tehnologije rekombinantne DNA zagotovi ekspresijo popolnoma heterolognih polipeptidov (tako imenovane direktne ekspresije) ali v drugi izvedbi - heterologne polipeptide, vezane na del aminokislinskega zaporedja homolognega polipeptida. V zadnjem primeru ciljni bioaktivni proizvod včasih ostane neaktiven v združenem homolognem heterolognem polipeptidu, dokler se ne razcepi v zunajcelično okolje (glej British Patent Publication No. 2007676A in American Scientist 68, 664 (1980)).

C. Tehnologija celične kulture.

Umetnost celične kulture ali tkiva je dobro razvita za proučevanje genetike in fiziologije celic. Znane so naprave in metode za vzdrževanje trajnih celičnih linij, dobljenih z zaporednimi serijami prenosov iz izomiranih normalnih celic. Za uporabo pri raziskavah se takšne celične linije vzdržujejo na trdnih substratih v tekočem mediju ali gojijo v suspenziji, ki vsebuje podporna hranila. Pridobivanje večjih količin drog se omejuje le na mehanske težave. Podrobnejši opis predpogojev v smislu izuma lahko najdemo v Microbiology and Edition, Harpes and Row Reblishers, Inc., Hagerstown, Maryland (1973), še posebej na strani 1122, in nadalje Scientific American 245, 66 in nadalje (1981), od katerih je vsak vključen tukaj kot referenco.

Predloženi izum temelji na odkritju, da se lahko tehnologija rekombinantne DNA uspešno uporabi za pridobitev humanega imunskega interferona, prednostno v neposredni obliki in v količinah, ki so zadostne za sprožitev in izvedbo testov na živalih in klinikah, ki je potrebna pred vstopom na trg. Ta izdelek je primeren za uporabo v vseh oblikah za preprečevanje in zdravljenje virusnih okužb, malignih novotvorb in stanj z zavrnjenimi ali okvarjenimi imunskimi sistemi. Njegove variante vključujejo različne oligomerne oblike, ki lahko vključujejo glikozilacijo. Ta proizvod se pridobiva v obnovljenih gensko spremenjenih mikroorganizmih ali v transformiranih sistemih celičnih kultur.

Kot se tukaj uporablja, se izraz "transformantna celica" nanaša na celico, v katero je vstavljena DNA, pri čemer je DNA produkt rekombinacije eksogene DNA, in na potomce katerekoli take celice, ki zadrži DNA, vneseno na ta način.

Tako je zdaj mogoče izdelati in izločiti humani imunski interferon bolj učinkovito kot prej. Eden od bistvenih dejavnikov pričujočega izuma v njegovi najbolj prednostni izvedbi je realizacija možnosti genetskega usmerjanja mikroorganizma ali celične kulture v produkcijo humanega imunskega interferona v zadostnih količinah za izolacijo izločenih gostiteljskih celic v zreli obliki.

Predloženi izum vključuje tako dobljeni humani imunski interferon, sredstva in metode za njegovo pripravo. Nadalje je predloženi izum usmerjen na vektorje za ekspresijo DNA, ki se lahko ponovijo in shranjujejo zaporedja genov, ki kodirajo humani imunski interferon, v obliki, ki je dostopna izražanju.

Predloženi izum se nanaša tudi na seve mikroorganizmov ali celične kulture, ki so bile transformirane z ekspresijskimi vektorji, opisanimi prej, in mikrobne ali celične kulture takih transformiranih sevov ali kultur, ki so sposobne proizvajati humani imunski interferon. V drugem vidiku je predloženi izum usmerjen na različne postopke, ki so primerni za pridobivanje označenih sekvenc gena za imunski interferon, DNA ekspresijske vektorje, seve mikroorganizmov in celične kulture in njihove specifične variante. Poleg tega je predloženi izum usmerjen v pridobivanje fermentacijskih kultur teh mikroorganizmov in celičnih kultur.

Predloženi izum je prav tako usmerjen v pridobivanje humanega imunskega interferona kot produkta neposredne ekspresije izločene gostiteljske celice v zreli obliki. Ta dosežek lahko uporablja gen, ki kodira zaporedje zrelega humanega imunskega interferona, plus 5-lankirno DNA, ki kodira signal polipeptid. možnost, da se izolira in očisti ciljni zrel imunski interferon, ne da bi se skliceval na vključitev postopka za odstranitev nečistoč intracelularnega proteina ali celic gostitelja. ranja fragmentov.

Izraz "humani zreli imunski interferon", kot je uporabljen v besedilu, pomeni mikrobno ali celično kulturo človeškega imunskega interferona, ki ne vsebuje signalnega peptida ali pred-peptidne sekvence, ki nujno spremlja translacijo mRNA človeškega imunskega interferona.

Prvi rekombinantni humani imunski interferon, dobljen v skladu s predloženim izumom, ima metionin kot svojo prvo aminokislino (predstavljeno kot rezultat vključitve kodona začetnega signala ATG pred strukturnim genom) ali, če je metionin intra - ali ekstracelularno cepljen, ima kot normalno prva amino kislina je cistein. Zreli humani imunski interferon lahko dobimo tudi kot konjugat z proteinom, ki ni normalen signalni polipeptid, in konjugat, ki se lahko specifično cepi znotraj ali zunaj celice (glej British Patent Publication 2007676A). In končno, zrel človeški imunski interferon lahko dobimo z direktno ekspresijo, ne da bi bilo potrebno odcepiti kateri koli tuji presežni polipeptidi. To je še posebej pomembno v primerih, ko dani gostitelj ni sposoben odstraniti ali premalo odstraniti signalnega peptida, in ekspresijski vektor je namenjen izražanju zrelega človeškega interferona skupaj z njegovim signalnim peptidom. Zreli humani imunski interferon, dobljen na ta način, se izolira in očisti do nivoja, ki izpolnjuje zahteve, potrebne za uporabo pri zdravljenju virusnih bolezni, malignih novotvorb in stanj z zavrto ali nezadostno imunostjo.

Humani imunski interferon smo dobili, kot sledi.

1. Človeška tkiva, na primer, tkivo vranice ali limfociti periferne krvi, so gojili z mitogeni, da bi spodbudili nastajanje imunskega interferona.

2. Celični pelet iz take celične kulture smo ekstrahirali v prisotnosti inhibitorja ribonukleaze za namen celotne citoplazmatske RNA.

3. Na oligo-dT koloni smo izolirali celotno informacijsko RNA (mRNA) v poliadenilirani obliki. RNA je bila frakcionirana v velikosti z gradientom gostote saharoze in gel elektroforezo v prisotnosti sečninske kisline.

4. Ustrezna RNA (od 12S do 18S) smo pretvorili v ustrezno enoverižno komplementarno DNA (mDNA), iz katere smo dobili dvoverižno cDNA. Po podaljšanju poli-dC je vključen v vektor, tako da ima plazmid enega ali več fenotipskih markerjev.

5. Tako pridobljene vektorje uporabimo za transformacijo bakterijskih celic, da dobimo knjižnico kolonij. Radioizotopsko označena cDNA, pridobljena iz obeh induciranih in neinduciranih RNA, izoliranih, kot je že opisano, je bila uporabljena za ločeno določanje dvojnih knjižnic kolonij. Nato odstranimo presežek cDNA in kolonije izpostavimo rentgenskemu filmu, da identificiramo inducirane klonove cDNA.

6. Iz induciranih klonov cDNA smo izolirali ustrezno plazmidno DNA in določili bazno zaporedje.

7. Sekvencirano DNA smo pripravili in vitro za vključitev v ustrezen ekspresijski vektor, ki smo ga uporabili za transformacijo primerne gostiteljske celice, ki je omogočila rast v kulturi in ekspresijo ciljnega človeškega imunskega interferona.

8. V nekaterih sistemih gostiteljskih celic, ki so vključene v ekspresijski vektor, tako da se eksprimirajo skupaj s signalnim peptidom, se zrela oblika humanega imunskega interferona izloči v medij celične kulture, kar olajša izolacijo in metode čiščenja.

Opis prednostnih izvedb izuma.

A. Sistem celične kulture / vektorji celične kulture.

Razmnoževanje vretenčarskih celic v kulturi (tkivni kulturi) je v zadnjih letih postalo običajen postopek (glej Kulturna kultura Akademski Riess Kruse in Paterson, 1973). V tem primeru je bila kot gostitelj za proizvodnjo imunskega interferona (25a) uporabljena COS-7 opica ledvične fibroblastne linije. Vendar pa se lahko eksperimenti, ki so podrobno opisani tukaj, izvedejo na kateri koli celični liniji, ki je sposobna repliciranja in ekspresije kompatibilnega vektorja, na primer W138, BHK, 3T3, CHO, VERO in HeLa celične linije. Poleg tega je potrebno, da ima ekspresijski vektor mesto za iniciacijo replikacije in promotor, ki se nahaja pred genom, ki ga je treba eksprimirati, skupaj s potrebnimi ribosomskimi vezavnimi mesti, mesti za spajanje RNA, poliadenilacijskimi mesti in transkripcijskimi terminatorji. Čeprav so bili tukaj uporabljeni ti pomembni elementi SV40, je treba upoštevati, da se izum, čeprav je tukaj opisan z vidika njegove prednostne izvedbe, ne sme šteti za omejen samo na ta zaporedja. Lahko se na primer uporabijo viri za razmnoževanje drugih virusnih (npr. Polyoma, Adeno, VSV, BPV, itd.) Vektorjev, kot tudi celični viri replikacije DNA, ki lahko delujejo v neintegriranem stanju.

B. Ekspresija v kulturi celic sesalcev.

Strategija za sintezo imunskega interferona v kulturi celic sesalcev temelji na razvoju vektorja, ki je sposoben avtonomne replikacije in ekspresije tujega gena pod nadzorom heterolognega transkripcijskega fragmenta. Replikacija tega vektorja v tkivni kulturi je bila dosežena s stimulacijo iniciatorja replikacije DNA (ki izvira iz virusa SV 40) in stimulacije pomožne funkcije (T antigen) z uvedbo vektorja v celično linijo, ki izraža ta antigen endogeno (23 in 29). Pozni promotor virusa SV 40 pred strukturnim genom interferona in zagotavlja transkripcijo gena.

Vektor, uporabljen za ekspresijo, je bil sestavljen iz pBR 322 sekvenc, ki zagotavlja marker, ki je primeren za selekcijo v E. coli (ampicilinsko odporna), kot tudi iniciator DNA replikacije. Te sekvence smo dobili iz plazmida pML-1 (28) in predstavljali regijo, ki vsebuje ECo RI in BamHI restrikcijska mesta. Pobudnik SV 40, pridobljen v sestavi fragmenta PVu II - Hind III velikosti 342 p. O., vključno s to regijo (30 in 31) (oba konca sta se spremenila v konce Eco RI). Te sekvence, poleg tega, da vsebujejo virusni replikacijski iniciator DNA, kodirajo promotor za zgodnje in pozne transkripcijske enote, je usmeritev iniciacijskega območja iz SV-40 taka, da je promotor za pozno transkripcijsko enoto lociran proksimalno sorazmerno z genom, kodiranje interferona.

SL. 1 prikazuje gradientno saharozno centrifugiranje limfocitov periferne krvi, stimuliranih s poli (A) + RNA. Obstajata dve maksimumi aktivnosti interferona (prikazani s senčnimi pravokotniki) z velikostmi 12S in 16S. Lokacija markerjev rRNA (neodvisno centrifugiranih) je označena nad konturo absorpcije.

SL. Slika 2 prikazuje poli (A) + RNA elektroforezo, stimulirano s PBL na kislinsko-urejevi agarozi. Opazimo le en vrh aktivnosti, ki migrira skupaj z 18S RNA. Položaj ribosomskih RNA markerjev, ki so bili izpostavljeni elektroforezi na sosednjem tiru in se je manifestiral z barvanjem z etidijevim bromidom, je označen nad konturo aktivnosti.

SL. Slika 3 prikazuje hibridizacijske vzorce 96 kolonij z induciranimi in neinduciranimi 32P označenimi vzorci cDNA. 96 mikroorganizmov smo gojili na mikrotitracijski plošči, repliko smo dali na dve nitrocelulozni membrani, nato pa smo filtre hibridizirali s 32 P-cDNA vzorci, dobljenimi bodisi iz inducirane mRNA (zgoraj) ali iz mRNA, izolirane iz neinduciranih pBL kultur (neinduciranih, dnb). ). Filtre smo sprali, da smo odstranili ne-hibridizirano RNA in nato izpostavili rentgenskemu filmu. Ta serija filtrov predstavlja 86 takih serij (8.300 samostojnih kolonij). Primer induciranega klona je označen s H12.

SL. 4 je restrikcijska mapa cDNA vstavka klona 69. cDNA insert je vezan na Pstl mesta (točke na obeh koncih) in oligo-dC-dG repa (ravne črte). Število in velikost fragmentov, dobljenih z razdelitvijo restrikcijskih nukleaz, smo določili z elektroforezo s 6% akrilamidnim gelom. Lege ploskev so bile potrjene s sekvenciranjem (prikazano na sliki 5). Kodirni odsek največjega odprtega bralnega okvira je obdan, osenčeno območje predstavlja 20 ostankov signalne peptidne sekvence, medtem ko črtkana črta predstavlja zaporedje zrelega IEN (46 aminokislin); 5 "- konec mRNA je na levi in ​​3" na desni.

SL. 5 kaže nukleotidno sekvenco cDNA vstavka plazmida p69. Predstavljena je tudi »izpeljana« aminokislinska sekvenca najdaljšega odprtega čitalnega mesta. Domnevna signalna sekvenca je predstavljena z ostanki, označenimi s S1 do S20.

SL. 6 je shema plazmida pSV 69, uporabljenega za ekspresijo IFN-y v celicah opic.

SL. 7 prikazuje južno hibridizacijo 8 različnih EcoRI prebavljenih človeških genomskih DNA, hibridiziranih z 32 P-označenim DdeI fragmentom 600 bp. iz vstavka cDNA p69. Dva Eco RI fragmenta sta jasno hibridizirana s sondo v vsakem DNA vzorcu.

SL. Slika 8 prikazuje južno hibridizacijo humane genomske DNA prebavljene s 6 različnimi restrikcijskimi endonukleazami, hibridizirane s 32 P označeno sondo s p69.

A. Vir IFN-mRNA
Limfocite periferne krvi (PBL) so pridobili od darovalcev (ljudi) z levkoforezo. Nato smo PBL očistili z gradientnim centrifugiranjem v zmesi fikol-heparina in nato gojili pri koncentraciji 5 10 6 celic / ml v RPMI 164 z 1% L-glutamina, 25 mM HEPS in 1% raztopine penicilina-streptomicina (Gibco Jrand gsland, Ny ). Te celice so bile inducirane za tvorbo IFN-mit mitogenega stafilokoknega enterotoksina B (N μg / ml) in gojejo 34 do 48 ur pri 37 ° C v 5% CO. K kulturi PBL smo dodali desacetiltimozin - (0,1 µg / ml), da bi povečali relativni izkoristek aktivnosti IFN.

B. Izolacija sporočilne RNA.

Celotno RNA iz PBL kultur smo ekstrahirali predvsem po sporočilu Bergen, S.L. et al. (33). Celice smo izolirali s centrifugiranjem in nato resuspendirali v 10 mM NaCl, 10 mM TrCS-HCl (pH 7,5), 1,5 mM MgCl.2 in 10 mM ribonukleozid-vanadil kompleks. Celice smo lizirali z dodajanjem NP-40 (končna koncentracija 1%) in jedra izolirali s centrifugiranjem.

Supernatant je vseboval celotno RNA, ki smo jo nadalje očistili z večkratnimi ekstrakcijami s fenolom in kloroformom. Vodno fazo smo pripeljali na 0,2 M NaCl in nato vsa RNA oborili z dodajanjem dveh volumnov etanola. RNK neinduciranih (nestimuliranih) kultur smo izolirali na enak način. Oligo-dT celulozno kromatografijo (34) smo uporabili za prečiščevanje mRNA iz drugih vrst RNA. Značilni pridelki 1–2 l kultiviranega PBL so bili 5–10 mg celotne RNA in 50-200 μg poli (A) + PHK.

C. Frakcioniranje mRNA po velikosti.

Za frakcioniranje pripravkov mRNA sta bili uporabljeni dve metodi. Te metode so bile uporabljene neodvisno (in ne skupaj) in vsaka od njih je privedla do pomembne obogatitve IFN-mRNA.

Za frakcionacijo mRNA smo uporabili gradient saharoze v prisotnosti formamida denaturanta. Gradijente od 5 do 25% saharoze v 70% formamidu (32) smo centrifugirali pri 154000 g 19 ur pri 20 ° C. Iz vrha gradiata smo izolirali serijske frakcije (0,5 ml), oborili z etanolom in nato alikvote je bila v družbo Xenopus laevis uvedena za prevajanje mRNA (35). Po 24 urah pri sobni temperaturi smo inkubacijski medij testirali na protivirusno aktivnost z uporabo standardne metode inhibiranja citopatskega učinka, z uporabo virusa vezikularnega stomatitisa (sev Indiana) ali virusa Eucepholomycarditis na celicah WISH (humani amnion), kot je opisal Stewart (36), razen da Vzorce inkubiramo s celicami 24 ur (namesto 4) pred okužbo z virusom. V skladu s tem smo opazili dva vrhova aktivnosti za frakcioniranje RNA v gradientu saharoze (sl. 1). En vrh je bil sedimentiran z izračunano velikostjo 12S in je vseboval 100-400 enot / ml protivirusne aktivnosti (v primerjavi s standardom IFN-y) na μg injicirane RNA.

Še en vrh aktivnosti sedimentira z velikostjo 16S in vsebuje približno polovico aktivnosti bolj počasi sedimentiranega vrha. Zdi se, da je vsak od teh vrhov aktivnosti povezan z IFN-a, ker za iste frakcije, proučene na liniji goveje celice (MDBK), ki niso zaščitene z humanim IFN-y, ni opaziti nobene aktivnosti. Aktivnost IFN-a in aktivnost IFN-a lahko enostavno določimo s preiskavo MDC (5).

Frakcioniranje mRNA (260 μg) je bilo prav tako izvedeno z elektroforezo preko kislo-sečninskega agaroznega gela. Viskozni agarozni gel (37 in 38) je vseboval 1,75% agaroze. Približno 025 M natrijevega citrata, pH 3,8 in 6M sečnine. Elektroforezo izvajamo 7 ur pri 25 mA in 4 ° C. Nato gel razrežemo z britvico. Ločene rezine so se talile pri 70 ° C, nato dvakrat ekstrahirali s fenolom in enkrat s kloroformom. Frakcije oborimo z etanolom, zaporedno analiziramo vsebnost IFN-y mRNA z uvedbo Xenopus laevis v družbo in nato izvedemo protivirusno analizo. Za vzorce, ki so bili frakcionirani v gelu, so opazili samo en vrh aktivnosti (slika 2). Ta vrh poteka skupaj z 18S in ima aktivnost 600 enot / ml na mikrogram injicirane RNA. Zdi se, da je ta aktivnost specifična tudi za IFN-α, ker ne ščiti celic MDVC. Razlika v velikosti, ki jo opazimo pri gradientih saharoze (12S in 16S) in kislinsko-sečninskih gelih (18S), je mogoče pojasniti z dejstvom, da so bile te neodvisne frakcionacijske metode izvedene v neenakih pogojih popolne denaturacije.

D. Pridobivanje knjižnice kolonij
ki vsebujejo sekvence IFN-.

Za pripravo dvoverižne cDNA s standardnimi postopki (26 in 39) smo uporabili 3 mg gelsko razvrščene mRNA; CDNA je bila frakcionirana po velikosti na 6% poliakrilamidnem gelu. Frakcije dveh velikosti so bile elektroelirane, 800 - 1500 bp. (138 ng) in> 1500 bp (204 ng). Porcije 35 ng vsake velikosti cDNA smo razširili z deoksi C ostanki s terminalno deoksinukleotidno transferazo (40) in žarili s 300 ng plazmida pBK 322 (41), ki je bil prav tako navzkrižno povezan z deoksi ostanki na mestu Pst I (40). Vsako renaturirano zmes nato pretvorimo v sev E.coli K12 294. Približno 8000 transformantov dobimo s cDNA 800-1500 bp. in 400 cDNA transformantov> 1500 bp

E. Izolacija iz knjižnice kolonij
inducirana cDNA.

Dobljene kolonije smo ločeno inokulirali v vdolbine mikrotitrskih plošč, ki so vsebovale LB (58) + 5 mc / ml tetraciklina in shranjevali pri -20 o C po dodatku HPMSO do 7%. Dve kopiji knjižnice kolonij smo gojili na nitroceluloznih filtrih in DNA iz vsake kolonije smo fiksirali na filter po Gruushtein-Hogness metodi (42).

32 P-cDNA označene sonde smo pripravili z uporabo 18S gel-frakcionirane mRNA iz induciranih in neinduciranih PBL kultur. OligoT 12-18 smo uporabili kot primerje; uporabljeni reakcijski pogoji, opisani prej (I). Filtri, ki vsebujejo 8000 transformantov z velikostjo cDNA 600-1500 bp. in 400 transformantov z velikostjo cDNA več kot 1500 bp. hibridizirali z 20 10 6 CPM-inducirano 30 P-cDNA. Dvojni filter je bil hibridiziran z 20 x 6 cpm neinducirane 32 P-cDNA. Hibridizacijo izvedemo 16 ur ob uporabi pogojev, ki sta jih opisala Fritsch et al (43). Filtre smo temeljito sprali (43) in nato izpostavili Kodakov XR-5 rentgenskemu filmu z uporabo Du Pont Lighitning-Plus. intenziviranje zaslonov za 16 do 48 ur, primerjava vzorca hibridizacije za vsako kolonijo z dvema vzorcema.

Približno 40% kolonij je bilo jasno hibridizirano z obema sondama, medtem ko približno 50% kolonij ni hibridiziralo z eno samo sondo (glej sliko 3). 124 kolonij je bilo izrazito hibridizirano s posamezno sondo, vendar nezaznavno ali zelo šibko z neinducirano sondo. Te kolonije so bile posamično inokulirane v vdolbine mikrotitrskih plošč, gojene in prenesene v nitrocelulozne filtre, nato pa hibridizirane z istima dvema vzorcema, kot je opisano zgoraj. Plazmidna DNA, izolirana iz vsake od teh kolonij s hitro metodo (44), je bila povezana tudi z nitroceluloznimi filtri in hibridizirana (45) s stimuliranimi sondami. DNA iz 22 kolonij, hibridiziranih samo z indukcijskimi sondami, smo imenovali "inducirane" kolonije.

F. Značilnosti induciranih kolonij.

Plazmidno DNA smo dobili iz 5 induciranih kolonij (46) in uporabili za karakterizacijo cDNA vstavka. Omejitveno označevanje petih induciranih plazmidov (p67, p68, p69, p70 in p71) je pokazalo, da imajo štiri od njih podobne restrikcijske karte. Vsak od teh štirih plazmidov (p67, p69, p71 in p72) ima štiri Dde ploskve, 2 Hinf 1 ploskve in eno Rsa 1 ploskev v vstavku cDNA. Peti plazmid (p68) vsebuje običajni Dde 1 fragment in je očitno kratek cDNA klon, ki spada v druge štiri. Homologijo, predpostavljeno na podlagi kartiranja z uporabo restrikcijskih nukleaz, smo potrdili s hibridizacijo. Pripravljen je bil 32 P-označen DNA vzorec (47) iz DdeI fragmenta velikosti 600 bp. plazmidi p67 in uporabljeni za hibridizacijo (42) z ostalimi induciranimi kolonijami. Vse pet koloniziranih koloniziranih restrikcijskih kolonij nukleaze je križno hibridiziralo s to sondo, kot tudi 17 drugih od 124 kolonij, izbranih med pregledovanjem. Dolžino vstavka cDNA v vsakem od teh križno hibridizirajočih plazmidov določimo z razgradnjo PstI in uporabo gel elektroforeze. Klon z najdaljšim vstavkom cDNA se zdi, da je klon 69 z velikostjo vložka 1200-1400 bp. To DNA smo uporabili v vseh nadaljnjih poskusih, njena restrikcijska karta je prikazana na sl. 4

Vstavek cDNA v p69, kot je prikazano, je IFN-cDNA, pridobljen iz treh neodvisnih ekspresijskih sistemov za izdelke, ki kažejo antivirusno aktivnost, kot je podrobneje opisano v nadaljevanju.

G. Analiza zaporednega vstavljanja cDNA p69.

Celotno nukleotidno zaporedje plazmidnega vstavka cDNA p69 smo določili po metodi zaključevanja dideooksukleotidne verige (48) po subkloniranju fragmentov v M13 vektor m7 (49) in s kemijsko metodo Maxama in Gilberta (52). Najdaljši odprt bralni okvir kodira 166 amino kislinski protein, prikazan na sl. 5. Prvi ostanek kodira prvi metioninski kodon, ki je vključen v 5 "konec cDNA. Prvih 20 ostankov na amino koncu verjetno služi kot signalna sekvenca za izločanje preostalih 146 aminokislin. Ta domnevna signalna sekvenca z drugimi znanimi signalnimi zaporedji je kombinirana, na primer, velikost in hidrofobnost Poleg tega so bile štiri aminokisline, najdene v domnevni cepljivi sekvenci (ser-leu-glu-cys), identične s štirimi ostanki, najdenimi na točki cepitve več levkocitov. s interferone (Leif B, C, D, F in H (2)). kodiranega zrelo aminokislinsko sekvenco 146 amino kislin (v nadaljevanju "rekombinantni humani imunski interferon") molekulsko maso 17140.

Obstajata dve potencialni poziciji glikozilacije (50) v zaporedju kodiranih proteinov, v amino kislinah od 28 do 30 (asn-gly-thr) in aminokisline od 100 do 102 (asn-tyr-ser). Obstoj teh določb je skladen z opaženo glikozilacijo človeškega IFN- (6 in 51). Poleg tega sta samo dva cisteinska ostanka (položaji 1 in 3) sterično preveč blizu, da tvorita disulfidni most, kar je skladno z opazovano stabilnostjo IFN-y v prisotnosti reducentov, kot je IFN-y-merkaptoetanol (51). Izpeljana zrela aminokislinska sekvenca je na splošno glavna, s skupno 30 lizinskih, arginskih in histidinskih ostankov in skupaj 19 ostankov aspartinske in glutaminske kisline.

Struktura IFN-y mRNA, določena iz plazmidne DNA zaporedja p69, se izrazito razlikuje od IFN- (1,2) ali IFN- (5) mRNA. Tako je kodirna regija IFN- krajša, čeprav so 5 "neprevedenih in 3" neprevedenih področij veliko daljše kot v IFN-FN- in IFN-.

H. Struktura kodirne sekvence gena IFN-.

Strukturo gena, ki kodira IFN-y, analiziramo s hibridizacijo. V tem postopku (54) se 5 μg človeške DNA z visoko molekulsko maso (dobljeno po metodi 55) razgradi do konca z različnimi restrikcijskimi endonukleazami, elektroforeza se izvede na 1,0% agaroznem gelu (56) in prenese v nitrocelulozni filter (54). Vzorec 32 P-označene DNA pripravimo (47) iz 600 bp DdeI fragmenta. p69 cDNA vstavi in ​​hibridizira (43) z DNA madežem na filtru. 10 pulsov vzorca na minuto hibridiziramo 16 h in nato speremo, kot je opisano (43). Osem vzorcev genomske DNA iz različnih darovalcev (ljudi) smo razgradili z Eco RI in hibridizirali s p69 32 P-označeno sondo. Kot je prikazano na sl. 7, obstajata dve različni hibridizacijski signali z velikostjo 8,8 m. in 2,0 m.o., ki se ugotovi s primerjavo mobilnosti s Hind III digestirano DNA. To je lahko posledica prisotnosti dveh genov IFN-genov ali enega gena, prebavljenega na mestu Eco RI. Ker cDNA p69 ne vsebuje EcoRI lokacij, da bi pojasnili svojo prisotnost v genu, bo treba sprejeti vmesno zaporedje (intron) z notranjim Eco RI mestom. Da bi razlikovali med tema dvema možnostma, je bila izvedena še ena hibridizacija južne z isto sondo in pet drugih endonukleaznih digestij ene človeške DNA (sl. 8). Dva hibridizirana DNA fragmenta sta bila opažena za druge endonukleazne digestije, PVUII - 6.7 kb. in 4.0 in Hinc II (2.5 kb in 2.2 kb). Vendar pa preostale tri slike endonukleazne digestije dajejo samo en fragment hibridizirajočega DNA: Hind III (9,0 kb), Bdl II (11,5 kb) in BamHI (9,5 tone). o.) Dva IFN-gena morata biti povezana z nenavadno kratko razdaljo (manj kot 9,0 kvr), da sta v istem fragmentu Hihd III. Ta rezultat kaže, da je samo en homologen IFN-gen (za razliko od mnogih genov, povezanih z IFN) prisoten v humani genomski DNA in da je ta gen ločen z enim ali več introni, ki vsebujejo Eco RI, PVU II in Hind II mesta. Ta predpostavka je bila potrjena s hibridizacijo 32 P-označenega (47) fragmenta, pridobljenega iz 3 'netranslatiranega območja cDNA iz p69 (130 bp. DdeI fragment iz 860 položaja na 990 položaj na sliki 5) z EcoRI prebavo človeške genomske Samo 2,0 kb EcoRI fragmenta hibridizira s to sondo, kar kaže, da ta fragment vsebuje 3 "ne-prevedene sekvence, medtem ko 3,8 kb. Eco RI fragment vsebuje 5 "sekvenc. Struktura gena IFN- (en gen z vsaj enim intronom) se bistveno razlikuje od IFN- (mnogi geni (2) brez introna (56)) ali IFN- (en gen brez intronov (57)). )).

J. Konstrukcija vektorja celične kulture pSV 69.

Fragment 342 parov baz Hind III-PVU III, vključno z iniciatorjem SV40, smo pretvorili v fragment, vezan na EcoRI restrikcijsko mesto. Hind III mesto smo pretvorili z dodajanjem sintetičnega oligomera (5d AGCTGAATTC) in mesto PVU II smo pretvorili s šivanjem na topem koncu v Eco RI mesto in ga dopolnili s polimerazo I (Klenow fragment). Nastali EcoRI fragment smo vstavili v Eco RI pML mesto (28). Plazmid s poznim promotorjem SV40, ki je bil usmerjen proč od amp R gena, je bil nadalje modificiran z odstranitvijo EcoR I mesta najbližjega amp R pML-1 genu (27).

Izoliral se je fragment 1023 baznih parov HpaI-BglII iz HBV klonirane DNA (60) in spletna stran HpaI virusa hepatitisa B (HBV) je bila pretvorjena v Eco RI mesto s sintetičnim oligomerjem (5 "dGGGAATTCGC). Ta fragment Eco RI-Bgl II je bil direktno kloniran v Eco RI - BamH I, mesta plazmida, opisana prej, in nosilec iniciatorja SV 40.

Preostalo EcoR1 mesto smo vstavili z IFN-kodirajočo sekvenco na Pst I fragmentu p69 od 1250 bp. ko se konča PstI v EcoRI. Te klonove smo izolirali, pri čemer je pozni promotor SV 40 pred IFN-genom. Nastali plazmid pSV 69 (slika 6) je bil nato uveden v celice tkivnih kultur (29), zlasti celic COS-7, z uporabo DEAE-dekstranskega postopka (61), modificiranega tako, da je bila transfekcija v prisotnosti DEAE-dekstrana izvedena za 8 h Medij celic smo zamenjali vsakih 2-3 dni. Za biološki test interferona smo zbrali 200 μl na dan. Tipični izkoristki so bili v vzorcih analiziranih tri ali štiri dni po transfekciji 50-100 U / ml.

Analiza je pokazala, da ekspresijski produkt nima cys-tyr-cys-N-terminalnega dela rekombinantnega humanega imunointerferona (prim. Sl. 5), kar kaže, da je fenomen cepitve signalnega peptida skozi cys-GLN vez (aminokisline 3 in 4 na Sl. 5) in da je zreli polipeptit dejansko sestavljen iz 143 aminokislin (gez-cys-Tyr-cys-imunski interferon).

J. Delno čiščenje rekombinantnega cis-cys-Tyr-cys-imunskega interferona.

Za pridobitev velike količine humanega IFN-y interferona, ki ga izločajo opičje celice, so bili sveži monosloji COS-7 celic v desetih 10 cm ploščah transficiranih na skupno 30 μg pDL 1 3 v 110 ml DEAE-dekstrana (200 μg / ml DEAE dekstrana 500000 MW; 5M Tris pH 7,5 v DMEM). Po 16 urah pri 37 ° C smo plošče dvakrat sprali z DMEM. Na vsako ploščo smo dodali 15 ml svežega DMEM, dopolnjenega z 10% f.b.s., 2 mM glutamina, 50 μg / ml penicilina G in 50 mg / ml streptomicina. Medij smo nadomestili z DMEM brez seruma. Nato vsak dan dodamo svež medij brez seruma. Pridobljeni medij smo shranili pri 4 ° C, dokler se ni uporabil za analizo, ali vezal na CPG. Ugotovljeno je bilo, da so frakcije, zbrane po 3 in 4 dneh po transfekciji, ohranile skoraj vso aktivnost.

100 g CPG (Electonucleonics CPG 350 nadzorovane porozne velikosti stekla v vrečah 120/200) smo dodali v 100 ml celičnega supernatanta in zmes mešali 3 ure pri 4 ° C. Po kratkem centriranju v zgornji centrifugi smo nasičene kroglice napolnili. kolono in temeljito izperemo z 20 mM NaPO pufrom4, 1M NaCl, 0,1% merkaptoetanola, pH 7,2. Nato aktivnost eluiramo z istim pufrom, ki vsebuje 30% etilen glikola, čemur sledi eluiranje z zgornjim pufrom, ki vsebuje 50% etilen glikola. Skoraj vsa dejavnost je povezana s CPG. 75% eluirane aktivnosti smo našli v frakcijah, ki smo jih eluirali s 30% etilen glikola. Te frakcije zberemo in razredčimo z 20 mM NaPO4 1M NaCl, pH 7.2 do končne koncentracije 10% etilen glikola in neposredno vbrizga v 10-mililitrsko kolono Con A Sepharose (Pharmacia). Po temeljitem pranju z 20 mM NaPO4 - 1M NaCl, pH 7.2, aktivnost eluirana z 20 mM NaPO4 - 1M NaCl - 0,2 M-metil-D-manozid. Pomembna količina aktivnosti (55%) ni povezana s tem lektinom, 45% aktivnosti je eluirano z -metil-D-manozidom.

K. Farmacevtske sestavine.

Spojine v smislu predloženega izuma lahko vključimo v skladu z znanimi postopki v farmacevtsko sprejemljivih sestavkih, v katerih je humani imunski interferon združen v zmesi s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem. Primerni nosilci in njihovi sestavki so opisani v Pemington 's Pharmaceutical Science, ki je vključen z referenco. Takšni sestavki morajo vsebovati učinkovito količino interferona proteina v skladu s predloženim izumom skupaj z ustrezno količino nosilca za proizvodnjo farmacevtsko sprejemljivega sestavka, primernega za učinkovito dajanje pacientu.

Humani imunski interferon v smislu predloženega izuma lahko parenteralno dajemo pacientu, za katerega je potrebno protitumorsko ali protivirusno zdravljenje, kot tudi tistim v imunosupresiranem stanju. Odmerki in pogostnost dajanja so lahko podobni tistim, ki se običajno uporabljajo v kliničnih študijah z drugimi humanimi interferoni; to je približno (1–10) 10 6 enot dnevno, v primeru materialov s čistostjo nad 1%, očitno do 50 10 6 enot. dnevno Odmerki IFN-a se lahko znatno povečajo, da dosežemo večji učinek, ki je povezan s praktično odsotnostjo človeških proteinov, ki niso IFN-a, ki lahko, kadar se uporablja z materiali, ki izvirajo iz človeka, povzročijo nasprotni učinek.

Kot primer primernega odmerka za v bistvu homogenega IFN-y, uporabljenega tukaj v parenteralni obliki, je mogoče navesti 3 mg. IFN-specifično aktivnost, recimo 2 8 8 u / mg, lahko raztopimo v 25 ml 5 n. serumski albumin (humani) USP, raztopino prenesemo skozi bakteriološki filter in filtriramo raztopino aseptično razdelimo na 100 ampul, od katerih vsaka vsebuje 6 10 6 enot. čisti interferon, primeren za parenteralno dajanje. Pred uporabo se ampule po možnosti shranijo na mrazu (-20 o C).

1. Karakterizacija protivirusnega delovanja.

Za nevtraliziranje protiteles so bili vzorci po potrebi razredčeni s koncentracijo 500-1000 enot / ml z dodatkom PBS-BSA. Enake volumne vzorca smo inkubirali 2 do 12 ur pri 4 ° C z vrsto razredčitev kunčjih anti-človeških levkocitov, fibroblastov ali imunskega interferonskega antiseruma. Anti-IFN- in je prejel od Nacionalnega inštituta za alergijske in infekcijske bolezni. Anti-IFN-a pripravimo z uporabo estetskega IFN-y (čistoče 5-20%), očiščenega iz perifernih krvno stimuliranih limfocitov. Vzorce centrifugiramo 3 min pri 1200 x g 3 min pred testiranjem. Da bi preverili stabilnost pH 2, smo vzorce naravnali na pH 2 z dodatkom 1N. HCl, inkubiramo 2-12 ur pri 4 ° C in nevtraliziramo z dodatkom 1 n. NaOH pred študijo. Za testiranje občutljivosti natrijevega dodecil sulfata (SDS) smo vzorce inkubirali z enakim volumnom 0,2% SDS 2-12 ur pri 4 ° C neposredno pred analizo.

Značilnosti IFN, pridobljenih v COS-7 celicah, so podane v tabeli.
Ta tabela prikazuje značilno obnašanje standardov IFN-,, - po različnih obdelavah. Aktivnost interferona, pridobljena s COS-7 / psv 69, je občutljiva na kislino, občutljiva na SDS in je nevtralizirana z antiserumom imunskega interferona. Nevtralizirajo ga protitelesa proti IFN- ali. Ti podatki potrjujejo, da so produkti, dobljeni v tem sistemu, imunointerferoni in da DNA vložek plazmida p69 kodira IFN-y.

1. Goeddel et al., Nature 287, 411 (1930).

2. Goeddel et al., Nature 290, 20 (1981).

3. Yelverton et al., Nucleic Aceds Research 9. 731 (1981).

4. Gutterman et al., Annals of Int. Med. 93, 399 (1980).

5. Goeddel et al., Nucleic Acids Reseach 8, 4057 (1980).

6. Yip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 1601 (1981).

7. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 3469 (1981).

8. Bloom, Nature 289, 593 (1980).

9. Sonnenfeld et al., Cellular Immunol. 40, 285 (1978).

10. Fleishmann et al., Infection in Immunity 26, 248 (1979).

11. Blalock et al., Cellular Immunology 49, 390 (1980).

12. Rudin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (ZDA) 77, 5928 (1980).

13. Crane et al., J. Natl. Rak Inst. 61, 871 (1978).

14. Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979).

15. Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979).

16. Tschumper el al. Gene 10, 157 (1980).

17. Mortimer et al., Microbiological Reviews 44, 519 (198).

18. Miozzari et al., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978).

19. Jones, Genetics 85, 23 (1977).

20. Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980).

21. Hess et al., J. Adv. Enzim Regul. 7, 149 (1968).

22. Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978).

23. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4504 (1980).

24. Molekularna biologija kvasovk (11.-18. Avgust, 1981), Laboratorij Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, New York.

25. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44, 613 (1975).

25a. Gluzman, Cell 23. 175 (1981).

26. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979).

27. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977).

28. Lusky et al., Nature 293, 79 (1981).

29. Gluzman et al., Cold Spring Harbour Symp. Quant. Biol. 44, 293 (1980).

30. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978).

31. Reddy et al., Science 200, 494 (1978).

32. Boedtker et al. Prog. v Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 19, 253 (1976).

33. Berger et al., Biochemistry 18, 5143 (1979).

34. Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972).

35. Gurdon et al., J. Molec. Biol. 80, 539 (1975).

36. Stewart, Interferonski sistem. Springer, New fork, str. 13-26 (1979).

37. Lehrach et al., Biochemistry 16, 4743 (1977).

38. Lynch et al., Virology 98, 251 (1979).

39. Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978).

40. Chang et al., Nature 275, 617 (1978).

41. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977).

42. Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ZDA 72, 3961 (1975).

43. Fritsch et al., Cell 19, 959 (1980).

44. Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).

45. Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979).

46. ​​Clewel s sod., Biochemistry 9, 4428 (1970).

47. Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976).

48. Smith, Methods Enzymol. 61, 560 (1980).

49. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981).

50. Winzler, Hormonal Proteins and Peptides (izd. Li) Academic Press, New York, str. 1 (1973).

51. Mathan et al., Nature 292, 842 (1981).

52. Maxam et al., Methods in Enzymol. 65, 490 (1980).

53. Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978).

54. Southern, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975).

55. Blin et al., Nucleic Acids Res. 3, 2303 (1976).

56. Lawn et al., Science 212, 1159 (1981).

57. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981).

58. Miller, Eksperimenti v molekularni genetiki, str. 431-3, Lab Cold Spring Harbor., Cold Spring Harbor, New York (1972).

59. Beggs, Nature 275, 104 (1978).

60. Valenzuela et al., Animal Virus Genetics (ed. Fields, Jaenisch in Fox) str. 57, Academic Press, New York (1980).

61. McCuthan et al., J. Natl. Rak Inst. 41, 351 (1968).

FORMULA IZUMA

Postopek pridobivanja humanega imunskega interferona, ki vključuje gojenje živalske celične linije, izolacijo in čiščenje ciljnega produkta, označen s tem, da kultiviramo celično linijo COS-7, transformirano z rekombinantnim plazmidom pSVj69 DNA in izoliramo des-Cys-Tyr-Cys-interferon.